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10x Genomics_北京博奥晶典生物技术有限公司

发布时间:2018/06/06 点击量:

10x Genomics公司推出了GemCode平台,通过条形码信息将Illumina短序列再次连接,获得更有研究价值的长片段信息。近期,10X Genomics还推出了升级版的Chromium系统,在GemCode的基础上整合单细胞测序。
 

10x Genomics


10X Genomics平台基于微滴的核酸标签分配系统,这个系统提供了数以百万级的携带唯一DNA标签编码(Barcode)的微滴,通过微流控技术,将这些标签分配给不同的DNA片段或单个细胞,实现了长片段DNA测序和单细胞分辨率的转录组测序。

10x Genomics

 一、10x Genomics技术原理

  1、将样本分配到100,000s到1000,000s微反应体系,10x Genomics每个微反应体系含有一种特定的DNA序列标记。

  2、含有barcode信息的凝胶珠子首先与样品和酶的混合物混合,然后与位于微流体“双十字”连接中的油表面活性剂溶液结合。

10x Genomics

  3、GEMs (包含样品、酶、凝胶珠子的混合物油滴)流到储液器中并进行收集。10x Genomics凝胶珠子溶解释放barcode序列,开始对样本进行标记。将每个液滴中含有barcode信息的产物混合。然后构建标准测序文库。
 

10x Genomics

 二、 10x Genomics技术优势

  1、微量样本:仅需1ng 基因组DNA 即可进行长片段建库;

  2、精确分区:10x Genomics由于拥有众多的barcode和Partions,可对DNA进行精确分区;

  3、长片段信息:10x Genomics该技术可与Illumina测序仪进行无缝对接,利用短Reads可获得长达100Kb的片段;

  4、基因组组装质量提升:利用长片段信息结合Illumina组装数据组装的ScaffoldN50长度比单纯用Illumina方法提高十几倍。

  三、10x Genomics应用方向

  1、基因组测序:可提供超长片段的全基因组信息,进行突变检出、单倍体分型和基因组结构鉴定。10x Genomics能够揭示遗传性疾病关键的变异,并发现与癌症相关的关键改变。

  2、靶向测序:可提供长片段基因信息进行单倍体分型、结构变异检测和拷贝数测定。可得到短读长测序无法获得的基因组复杂区域和重复区域信息。

  3、单细胞测序:10x Genomics利用Chromium Single Cell 3, ,在细胞水平进行高通量数字化基因表达谱分析,可对复杂细胞群进行深入分析。追踪单个细胞的表达谱,避免单个细胞的生物学相关信号被大量细胞的平均化测定掩盖。

  4、从头组装:利用Supernova™ Assembler系统可发现真实的基因组信息,并且成本低,质量高。10x Genomics不需要任何类型的参考序列,即可揭示样本特异性序列,研究二倍体基因组结构。

 四、10x Genomics案例分析

1、去年PacBio公司在《Nature Methods》上发表了SMRT测序组装人类基因组的成果,选用的样本是HapMap样品NA12878。

2、10x Genomics采用Soapdenovo对人的基因组NA12878的Illumina short-reads进行拼接。

3、去除小于3Kb的Scaffold,得到的ContigN50为11.1Kb,ScaffoldN50为590Kb,10x Genomics在此基础上利用10X GemCode平台对人的基因组NA12878进行文库制备。

4、最终得到97X的linked reads数据,在原有的基础上加上linked reads对基因组进行组装,组装super-Scaffold。

  10x Genomics为了验证组装的Scaffold是否正确,我们对组装序列与参考基因组进行比对,发现利用此方法组装基因组完整性达95.2%,远高于AllPATHS-LG的组装。

同时为进一步验证组装的准确性,对组装序列的外显子进行比对发现95.7%的外显子在组装的新序列中。另外通过与参考基因组进行比对发现,在NA12878中存在14.3Mb的区域,10x Genomics这些区域在参考基因组中是不存在的,反映了不同人的NA12878和参考基因组的差异。

以上结果表明利用10X Genomics linked reads方法能够显著提高Illumina short read组装的Scaffold的长度,而且组装的基因组具有较高的准确性。

 五、10x Genomics测序技术发展趋势

  1、10x Genomics以Illumina HiSeq测序仪为代表的二代测序技术是将基因组DNA打断成小片段再进行测序,通过生物信息学手段将读取的小片段序列进行组装,而对于已经具备参考基因组的物种,则直接与参考基因组比对检测变异信息。

  2、由于此项技术在测序前将基因组DNA随机打断成小片段,根据测序仪的读取策略,每条测序序列的读取长度仅有100~300bp,10x Genomics无法辨别读取的序列信息是否来源于相同的DNA模版链,因此不利于单倍体分型(发生突变的遗传信息来源于亲本哪一方),对于结构变异(大片段DNA插入、缺失等变异)的鉴定也存在误差。

  3、10x Genomics利用测序得到的碱基排列信息还原基因组真实突变情况是测序研究的终极目标,将这一过程想象成拼图游戏,读取的遗传序列信息越长,每一块拼图越大,10x Genomics获得完整拼图原貌的难度越小,细节越接近拼图的原图,这也解释了为什么测序技术的发展趋势是获取大片段、长reads碱基序列信息。

        4 、三代单分子测序技术虽然可以直接对模版中的DNA分子进行测序,10x Genomics但是无与伦比的长读长伴随而来的是高测序错误率和昂贵的测序费用,制约了三代测序技术的应用和发展。




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